近日，我院欧阳臻教授、魏渊教授团队在中科院一区TOP期刊《International Journal of Biological Macromolecules》上发表了题为“Mining and characterization of a novel cytochrome P450 MaCYP71BG22 involved in the C4-stereoselective hydroxylation of 1-deoxynojirimycin biosynthesis in mulberry leaves”（https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.136941）的研究论文，该文挖掘和鉴定了桑叶DNJ生物碱生物合成途径关键羟基化过程中首个细胞色素P450（CYP450）羟化酶，并揭示了其参与桑叶中DNJ生物合成途径C-4的立体选择性羟基化及其机制，为桑叶DNJ生物碱生物合成的羟基化过程及生物合成途径的完整解析奠定了基础。

1-脱氧野尻霉素（1-Deoxynojirimycin，DNJ）多羟基生物碱是传统中药桑叶中防治糖尿病的主要活性成分，但其天然来源含量低、获取成本高，难以满足医药界需求。通过解析其生物合成途径，进而利用合成生物学策略高效可持续生产DNJ类多羟基生物碱有望成为其资源获取的新方法，但DNJ类多羟基生物碱的生物合成途径尚未完整解析。本研究团队前期解析了桑叶DNJ从赖氨酸到2-甲基哌啶上游生物合成途径并挖掘了多个功能酶（PeerJ, 2018；Protein Expres. Purifi., 2018；J. Agr. Food Chem., 2020；J. Agr. Food Chem., 2021；Planta, 2022；BMC Plant Biology, 2024），即L-赖氨酸在赖氨酸脱羧酶（LDC）作用下脱羧产生尸胺，尸胺经酮胺氧化酶（CAO）氧化脱氨基后形成5-氨基戊醛，之后自动环化形成Δ¹-哌啶烯，Δ¹-哌啶烯经还原酶（SDRs）还原后形成哌啶，哌啶在甲基转移酶（MTs）作用下形成2-甲基哌啶。但2-甲基哌啶经细胞色素P450酶（CYP450s）立体选择性羟基化形成DNJ的生物合成过程仍不清楚。

图1 桑叶DNJ生物碱生物合成途径推测

DNJ属于哌啶类多羟基生物碱，在C2位有1个羟甲基，C3-，C4-，C5-分别有一个羟基，解析羟基的立体构型是完整阐明其生物合成途径至关重要的环节。本文从桑叶转录组数据挖掘得到了4条CYP450s羟化酶基因的表达水平与DNJ积累量变化显著正相关，推测其为桑叶DNJ生物合成CYP450s羟化酶候选基因。对其中编码MaCYP71BG22羟化酶基因进行了克隆、表达和功能鉴定，结果显示MaCYP71BG22蛋白能够以（R）-2-甲基哌啶为底物催化（R）-2-甲基哌啶C-4位的立体选择性羟基化，经NMR和HRMS确认其羟化产物为（2R, 4R）-2-甲基哌啶-4-醇。另外，分别以哌啶、3-羟基哌啶、4-羟基哌啶、2-哌啶甲醇和Δ¹-哌啶烯为底物，考察了MaCYP71BG22的底物特异性，结果显示仅当以哌啶为底物时，才会出现一种新的羟基化产物，质谱数据库相似度比对为4-羟基哌啶，表明桑叶DNJ生物合成途径的羟基化顺序首先是2-甲基哌啶的C4位羟基化，然后再2-位甲基的立体选择性羟基化。农杆菌介导的桑遗传转化体系及病毒诱导基因沉默（VIGS）系统进一步验证了MaCYP71BG22基因对桑叶体内DNJ的积累量具有重要的调控作用。采用分子对接、同源建模及定点突变揭示了MaCYP71BG22羟化酶催化机制，结果显示G460为MaCYP71BG22羟化酶关键氨基酸残基。

图2 DNJ生物合成途径MaCYP71BG22羟化酶的筛选、功能验证及催化机制

综上，该文从桑叶转录组中挖掘及鉴定了DNJ生物合成途径首个CYP450羟化酶MaCYP71BG22，并探究了其催化机制，发现其能够催化（R）-2-甲基哌啶C-4位的立体选择性羟基化生成（2R, 4R）-2-甲基哌啶-4-醇，体内功能研究验证了其对桑叶DNJ的积累具有重要的调控作用。以上研究结果进一步证实了桑叶DNJ的生物合成前体可以来源于赖氨酸，而不仅仅是亚氨基糖，揭示了桑叶DNJ的生源途径的多样性，为桑叶DNJ生物合成途径的完整解析奠定基础。

欧阳臻教授为该论文的通讯作者，江苏大学为文章的唯一完成单位。本研究得到国家自然科学基金项目（82274040，81872961）及中央本级重大增减支项目（2060302）的资助。